疫苗产品中乙肝病毒表面抗原的纯化：配体密度对免疫亲和层析纯化 HBsAg 的影响

据世界卫生组织 (WHO) 统计，全球有超过 3.5 亿人是慢性乙型肝炎病毒 (HBV) 携带者 ( 1 )。约 25% 的携带者会发展为肝硬化和/或肝癌，每年有 100 万人死于 HBV ( 1 )。

该病毒呈球形，表面有一层脂蛋白，主要成分是 HBV 表面抗原 (HBsAg) ( 2 )。药物研发人员了解到这一点，他们基于在酵母或哺乳动物细胞中合成的 HBsAg 研制出重组 HBV 疫苗 ( 3, 4 )。为此，转化细胞在工业规模的发酵罐中培养，然后收集、纯化表达的抗原，并将其制成球形颗粒，从而暴露出高度免疫原性的“a”抗原决定簇区域 ( 5 )。

古巴哈瓦那的遗传工程和生物技术中心 (CIGB) 生产用于制造重组乙肝疫苗的 HBsAg (6)。由于该中心的努力，古巴成为世界上为数不多的为 15 岁以下人口接种乙肝疫苗的国家之一。因此，自 2007 年以来，古巴没有报告过该年龄段儿童感染乙肝的病例 (6)。

在重组 HBsAg 的生物制造过程中，主要的纯化步骤是免疫亲和层析 (IAC) ( 6 )，该技术于 20 世纪 30 年代首次实施。自大约 50 年前亲和层析技术诞生以来 ( 7 )，它已成为生命科学中一种非常宝贵的工具，因为它可以在单个纯化步骤中将蛋白质分离到高纯度 ( 8, 9 )，有助于后续纯化步骤的解决并节省时间和金钱 ( 10 )。IAC 介质的主要成分是载体和配体，通常分别是琼脂糖和单克隆抗体 (MAb)。选择载体是因为其表面积大、孔隙率可控、亲水性足以防止污染物的非特异性吸附，以及高压下的机械稳定性 ( 10, 11 )。通常，术语配体是指与靶分子相互作用的分子。为了用作配体，MAb 被固定在琼脂糖上。然后，对含有目标蛋白质的样品进行分离（9, 12）。

我们假设配体密度对于 IAC 纯化 HBsAg 工艺的成功至关重要，因为即使该参数发生微小变化，也会打开多个蛋白质吸附位点，导致配体分布不均一。此类问题会降低抗原吸附能力、抗原洗脱能力，最终降低抗原回收率。

材料
emp Biotech 的 Zetarose CL4 基质作为我们免疫吸附剂的载体。与 Sepharose CL-4B 基质 (Cytiva) 一样，Zetarose 产品的固体物质含量为 2-4%。因此，在 MAb 偶联过程结束时获得的配体密度（以每毫克干燥物质中的 MAb 量表示）可能很高（固体含量为 4%）或非常高（固体物质含量为 2%）。这种变化可能导致配体泄漏，以及批次间免疫吸附剂纯化能力的不良变化。

必须提高配体密度控制的准确性。考虑这样一种情况，用作配体的MAb的亲和常数很高（>10 ⁸ mol ^-1），并且MAb互补位识别的抗原表位在同一抗原分子或颗粒中重复。在这种情况下，考虑到所有涉及的表位和互补位，相互作用的总强度称为亲和力，比亲和常数值本身高出一个或两个数量级，因为不同的因素在稳定抗原和抗体之间的相互作用方面发挥作用（13）。

CB.Hep-1 MAb 是一种鼠 γ-免疫球蛋白 (IgG2k)，对 HBsAg 的“a”决定簇具有特异性。20 多年前就已明确 MAb 的互补位识别序列，该序列位于“a”决定簇的第一个环中 ( 14 )。该 MAb 还具有较高的亲和常数，范围从 10 ⁹ mol ^-1到 10 ¹⁰ mol ^-1 ( 15 )。最初在 HBV 感染患者血清中发现的 HBsAg（通常称为“澳大利亚抗原”）可以呈现为直径 ~21 纳米的球体，也可以呈现为宽度 ~21 纳米、长度可达几百纳米的丝状或管状。酵母细胞表达的重组 HBsAg 表现出与从人血清中分离的蛋白质相似的特性。电子显微镜显示该颗粒是由蛋白质（占总重量的 75%）和碳水化合物（占总重量的 25%）组成的复杂大分子聚集体。HBsAg 的氨基酸序列和组成负责在接种疫苗的人中诱导抗体，其中“a”抗原决定簇是用于产生保护性免疫体液反应的主要表位（16, 17）。据报道，22nm HBsAg 颗粒由 100 至 120 个单体组装而成（18），这表明相应的 CB.Hep-1 MAb 互补位识别的表位在每个 HBsAg 颗粒中可重复多达 100-120 次。

考虑到这些因素，我们研究了 CB.Hep-1 配体密度对 IAC 工艺效率的影响，该工艺用于纯化毕赤酵母产生的 HBsAg以用于 HBV 疫苗。

实验方法
富含CB.Hep-1 MAb的腹水制备： CB.Hep-1 MAb的分泌者——鼠杂交瘤48/1/5/4，由BALB/c小鼠（用天然HBsAg制剂免疫）脾细胞与Sp2/0-Ag14骨髓瘤细胞融合产生。为诱导腹水，将100万个细胞腹腔注射到体重22-24克的BALB/c小鼠体内（19）。

MAb纯化：收集腹水并储存于-20℃，在37℃下解冻，澄清并通过0.45～0.22μm囊体过滤，然后上样至装有Sepharose CL-4B Fast Flow Protein A树脂（Cytiva）的BPG 100/500玻璃层析柱（Cytiva）。以100cm/h的线性流速引入150mmol/L磷酸盐缓冲液（PBS，pH 8.0）的平衡缓冲液和洗涤缓冲液，并使用0.1mol/L柠檬酸（pH 5.0）和0.1mol/L柠檬酸（pH 3.0）以100cm/h的线性流速从柱中洗脱CB.Hep-1 MAb。接下来，我们将洗脱样品与第二洗脱缓冲液一起孵育一小时，然后在温和搅拌下用 2 mol/L tris（Merck）中和它们。随后，我们在装有 21 L Sephadex G-25（Cytiva）凝胶过滤介质的 BPG 200/750 柱中将样品缓冲液更换为 0.020 mol/L tris 和 0.150 mol/L NaCl（pH 7.6）。之后，通过超滤（Sartorius 仪器）浓缩纯化的 MAb，并在无菌条件下使用 0.22 µm 胶囊过滤。

Zetarose CL4 基质的活化：我们按照 Porath、Axen 和 Ernback ( 20 ) 报告的改良活化程序，用溴化氰 (BrCN) 活化 Zetarose 基质。使用该方案，我们省去了用 40% 丙酮进行干燥的步骤。

配体固定化：采用凝胶过滤层析法，将纯化的MAb样品缓冲液置换为100 mmol/L Na ₂ CO ₃、100 mmol/L NaHCO ₃和500 mmol/L NaCl（pH 8.3），层析柱中装有21 L Sephadex G-25粗级凝胶，然后用1 mmol/L HCl（5 L/L基质的比例）水化活化基质，再用100 mmol/L Na ₂ CO ₃、100 mmol NaHCO ₃和500 mmol/L NaCl（pH 8.3）平衡活化基质，层析柱中装有1.5 L/L基质的比例。接下来，我们将 MAb 溶液添加到活化的载体中以获得所需的配体密度（每毫升载体 2.80、3.00、3.20、3.60 和 3.80 毫克 MAb），在 23 °C 下搅拌两小时。用 200 mmol/L 甘氨酸（pH 8.0）以 2 L/L 基质的比例中和游离活性基团。然后交替清洗两次。第一次使用 100 mmol/L 乙酸钠 (C ₂ H ₃ NaO ₂ ) 和 500 mmol/L NaCl (pH 4.0)；下一次清洗涉及 100 mmol/L Na ₂ CO ₃、100 mmol/L NaHCO3 和 500 mmol/L NaCl (pH 8.3)（1 L/L 基质）。各免疫吸附剂分别储存在150 mmol/L PBS（pH 7.2）和0.01％硫柳汞中。

使用纯化的 HBsAg 样本评估免疫吸附剂性能：我们在装有 8.14 mL 免疫吸附剂的 PD-10 柱中对纯化的抗原样本进行 IAC，用 45 mL 20 mmol/L tris、3 mmol/L 乙二胺四乙酸 (EDTA) 和 0.5 mol/L NaCl (pH 7.39) 平衡，线性流速为 4.65 cm/h。以 155 µg HBsAg/mg MAb 的理论比率施加样本，线性流速为 4.65 cm/h。因此，对于每个配体密度（分别为 2.80、3.00、3.20、3.60 和 3.80 mg/mL），施加的体积分别为 3.50、3.80、4.10、4.70 和 6.20 mL。清洗步骤使用 20 mmol/L tris、3 mmol/L EDTA 和 1 mol/L NaCl（pH 7.38），流速为 7.67 cm/h。洗脱过程中，我们使用 20 mmol/L tris、3 mmol/L EDTA、0.5 mol/L NaCl 和 3 mol/L 硫氰酸钾 (KSCN)，流速为 7.76 cm/h。我们进行了 23 个净化循环。

未纯化 HBsAg 样本的免疫吸附挑战：将未纯化的 HBsAg 样本（5.06 mL）直接加入到 PD-10 柱中，比例为 155 µg HBsAg/mg MAb，线性流速为 4.65 cm/h。洗涤步骤使用 20 mmol/L tris、3 mmol/L EDTA 和 1 mol/L NaCl（pH 7.38），线性流速为 7.67 cm/h。随后的洗脱涉及应用 20 mmol/L tris、3 mmol/L EDTA、0.5 mol/L NaCl 和 3 mol/L KSCN，流速为 7.67 cm/h。每次净化循环后，通过应用 60 mL 0.1 mol/L tris 和 0.5 mol/L NaCl（pH 8.51）、100 mL 纯化水和 60 mL 0.1 mol/LC ₂ H ₃ NaO ₂、0.5 mol/L NaCl（pH 4.52）来再生基质。

我们在五个纯化循环中测量了吸附能力和效率、洗脱能力和效率以及抗原回收率和纯度（包括配体泄漏）。

方程式：色谱参数。*Inc = 收入，Inv = 投资，Op = 运营成本。

色谱参数的确定
上一页的“方程式”框列出了我们用来确定关键参数的数学表达式。

MAb 定量：将聚苯乙烯酶联免疫吸附测定 (ELISA) 板在 0.1 mol/L Na ₂ CO ₃和 0.1 mol/L NaHCO ₃ (pH 9.6) 中的 10 µg/mL HBsAg (100 µL/孔) 中在 50 ± 2 °C 下包被 20 分钟。接下来，将 100 µL 样品加入每个孔中，包括用于标准曲线点和对照的样品。将板放在湿室中，在 37 ± 2 °C 下孵育一小时。用 0.15 mol/L PBS 和 0.1% Tween-20 聚山梨醇酯 20 (MilliporeSigma) 溶液将板清洗四次，然后在 37 ± 2 °C 下与与辣根过氧化物酶 (MilliporeSigma) 结合的羊源多克隆抗鼠 IgG 制剂一起孵育一小时。再次将板清洗五次，用 100 µL 底物溶液展开反应，该溶液包含 5 mg 邻苯二胺 (OPD)、5 µL H ₂ O ₂和 10 mL 底物缓冲液（0.090 mol/L ₆ H ₈ O ₇ ·H ₂ O 和 0.200 mol/L Na ₂ HPO _{4 ，pH 5.5，来自 MilliporeSigma）。用 50 µL 1.5 mol/LH 2} SO ₄终止反应，并在 microELISA 读数仪（TiTertek，Multiskan MC340）上测定 492 nm 处的吸光度（15）。

总蛋白定量：我们使用 Lowry 法测定总蛋白浓度，以牛血清白蛋白 (BSA) 为参考材料 ( 21 )。应用标准曲线的值范围为 100 g/mL 至 500 g/mL。

HBsAg浓度：用Ultrospec 2000紫外可见光（UV-vis）分光光度计（Pharmacia Biotech）在280nm处测量HBsAg吸光度。我们使用表达式C _HBsAg = A/5确定抗原浓度，其中
C _HBsAg代表表面抗原浓度（mg/mL），A指样品的紫外吸光度值，5是摩尔消光系数。

HBsAg 纯度：我们遵循 Laemmli 等人描述的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE) 程序来评估回收抗原的纯度 ( 22 )。

配体泄漏：将孔板用羊源抗鼠多克隆抗体覆盖，在 2–8 °C 下放置过夜。然后，将孔板在 37 ± 2 °C 下封闭 30 分钟。清洗后，将样品从免疫吸附剂中洗脱，并在 37 ± 2 °C 下用 1% 脱脂牛奶和 150 mmol/L PBS（pH 8.0）孵育 3 小时。再次清洗后，将孔板与 100 µL/孔的与辣根过氧化物酶 (MilliporeSigma) 偶联的山羊源抗鼠多克隆抗体一起孵育。使用 100 µL/孔的 0.05% OPD 和 0.015% H ₂ O ₂在柠檬酸盐缓冲液（pH 5.0）中显色，并用 50 µL/孔的 1.25 mol/LH ₂ SO ₄终止反应。使用 492 nm 滤光片 ( 15 ) ，在 Multiskan ELISA 读数仪上测量吸光度值。

碳水化合物和脂质含量：我们按照 Carney 描述的分光光度法确定 IAC 洗脱液中的碳水化合物含量 ( 23 )。测量基于糖水解和酸降解的存在，证据是羟甲基糠醛的形成和在强酸性介质中与蒽酮反应时产生的其他衍生物。

我们按照 Woodman 和 Price ( 24 )描述的步骤，根据样品与硫酸/磷酸和香兰素的反应性，研究了洗脱液脂质含量。

统计和变量分析：我们对每次实验的结果取平均值。统计处理通过假设检验、方差分析 (ANOVA) 和 Kruskal-Wallis 检验进行验证。应用的显著性水平始终为 95%。在所有情况下，我们都使用了 Statgraphic Centurion XV（版本 15.2.06，Statistical Graphics Corp.）和 Microsoft Excel 软件。

结果与讨论
将生物分子固定在固体表面已得到广泛应用，包括亲和色谱法和分析方法（25, 26）。50 年后，亲和色谱法仍然是纯化生物活性分子的有力工具（7, 27）。它彻底改变了分子生物学、生物化学、生物技术和医学。

亲和色谱法根据抗原和抗体、酶和底物或受体和配体之间的特定相互作用分离生化混合物。通过允许目标分子与固定相相互作用和结合，实现高选择性。不需要的物质首先洗脱。然后，使用特定溶液或溶剂将目标蛋白从固体支持物上洗脱下来（28）。

IAC 是最受欢迎的基于亲和力的生物分离方法之一。MAb 有助于扩大其应用范围 ( 29 )。这种技术带来了无限数量的配体，因为 MAb 几乎可以针对任何化合物生产。目前，IAC 应用的数量似乎将继续增长——至少在生物活性概念验证研究期间单步分离目标蛋白是如此。然而，MAb 生产成本高和配体泄漏等因素可能会限制大规模制药应用的有效性。

许多 IAC 支撑材料都可以在市场上买到 ( 30 )。最受欢迎的支撑材料是琼脂糖，它对 IAC 非常有用，因为它不会在很大程度上吸收生物分子，具有良好的流动性，并且可以耐受极端的 pH 值、离子强度和变性剂。基于琼脂糖的基质的例子包括

• 交联珠状琼脂糖（例如，Cytiva 的 Sepharose 树脂和
Bio-Works 的 WorkBeads 40 尺寸排阻色谱 (SEC) 树脂）
• 高度交联珠状琼脂糖（Purolite 的 Praesto 树脂和 Cytiva 的 Superose 树脂）
• 与琼脂糖共价连接的葡聚糖（Cytiva 的 Superdex 树脂）。

有多种方法可用于固定配体 ( 31 )。将蛋白质固定在琼脂糖上很复杂，部分原因是相互作用力的结合。该原理首先使用高活性氰酸酯 ( 32, 33 ) 得到证实。对于琼脂糖载体，BrCN 活化一直是用于结合靶蛋白的配体附着的最常用方法。在此过程中，配体与琼脂糖珠的活化羟基共价连接。靶蛋白通过异脲结合与配体结合。

相反，结合异脲的电荷会破坏其与配体的连接，从而在纯化目标蛋白时产生多个问题。例如，结合抗体的持续泄漏会将不需要的配体痕迹污染所得药物物质。因此，通常采用多点配体附着。大量活性基团与低配体密度相结合有助于减少泄漏。

抗原抗体复合物的性质同样重要。高抗体亲和常数是 IAC 的关键参数。该方法涉及苛刻的抗原洗脱条件，这会增加配体的泄漏，降低配体的抗原识别能力，并破坏色谱载体的结构。如果一个过程涉及具有多表位抗原的高亲和力抗体，亲和常数对于评估来说就更为关键。在这种情况下，亲和力可能是最重要的参数。高值将表明抗体-抗原相互作用超过亲和力常数。